宁夏枸杞Lycium barbarumL.为茄科多年生落叶灌木，其成熟的干燥果实枸杞子为我国传统名贵中药材，同时又是国家卫生部公布的药食同源品种之一，在我国已有2000多年的用药历史[1]。现代医学、营养学和药理学研究发现，宁夏枸杞的果实、叶、根中都含有人体所需的多糖、氨基酸、维生素、微量元素等，具有极高的药用价值和营养价值[2]。

雄性不育（male sterility，MS）是植物界存在的普遍现象，是指在有性繁殖过程中雌蕊正常发育，而雄蕊不能正常生长发育和产生有效花粉[3]。植物雄性不育是一个极其复杂的过程，花药败育形式多样、败育程度各异，在雄蕊分化到成熟花粉粒形成的不同时期均有可能发生，主要表现为雄蕊退化或形态异常、减数分裂异常、小孢子退化、绒毡层功能缺陷、能形成可育的花粉但是花药壁无法正常打开等败育形式[4-5]。雄性不育现象是植物研究的热点之一，已成为作物育种的主要方向和目标，被广泛用于促进杂交作物的育种过程。在杂交育种中，以 雄性不育系为材料控制授粉，在水稻、玉米等作物中已获得高产杂交品种[6]。由于线粒体和核基因之间的相互作用，MS表型无法产生功能性花药、花粉或雄配子[7]。因此，了解花药和花粉发育的微妙而复杂的过程是理解MS植物中这一独特现象的先决条件。然而，花药和花粉发育是植物生命周期中的一个关键阶段，它包含一系列相关事件，涉及复杂调控网络中的多种基因[8]。相关基因的功能障碍可能导致雄性不育[9]。尽管有许多雄性不育相关基因已被分离，并鉴定其在MS中的具体功能，但MS发生的调控网络和新基因在很大程度上仍然未知[10]。

RNA-Seq以其技术优势，被广泛应用于植物雄性不育相关差异表达基因的识别、SNP筛选及基因表达量等方面的研究[11]。尤其是丰度非常低的基因[12-13]。

关于宁夏枸杞雄性不育转录组及相关基因表达方面的研究较少。张兴等[14]通过转录组技术，发现了宁夏枸杞雄性不育品种“宁杞5号”成熟花粉时期与雄性不育形成相关的差异表达基因。本研究在前人研究基础上，通过RNA-Seq技术分析宁夏枸杞不育品种“宁杞5号”与可育品种“宁杞1号”单双核时期的花药转录组差异，并对筛选到的雄性不育相关候选基因进行qRT-PCR分析。研究结果为枸杞花药发育及雄性不育发生的机制提供研究基础和参考。

1 材料

宁夏枸杞雄性不育品种“宁杞5号”与可育品种“宁杞5号”，于2019年6月采摘于宁夏育新公司（106°6'11.516"E，38°31'1.808"N）试验田的5龄树，大田栽培管理，生长气候条件相同。由宁夏大学郑蕊博士鉴定为宁夏枸杞L. barbarumL.的干燥果实。 采用对角线取样法，分别采摘“宁杞5号”和“宁杞1号”枸杞花蕾，参考徐青等[15]的方法，按照显微镜观察形态结合花蕾纵横经长度确定花药发育时期。于冰上剥取单双核花粉期花药（图1），存于2 mL无菌离心管，立即置于液氮中速冻后，存于−80 ℃备用。样品材料分别设3个生物学重复，“宁杞1号”3个样品编号为T1、T2、T3，“宁杞5号”3个样品编号为T4、T5、T6。

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2 方法

2.1RNA提取及测序文库构建

将−80 ℃保存的单双核花粉期花药，于干冰条件下送至北京百迈客生物公司进行cDNA文库构建和转录组测序。

2.2转录组测序及组装

使用Illumina HiSeq2500高通量测序平台对cDNA文库进行测序，用Trinity软件对过滤后的Clean data进行序列组装。

2.3功能注释

使用BLAST软件将获得Unigene与NCBI的非冗余蛋白质数据库（non-redundant protein databasse，NR）、基因本体数据库（gene ontology，GO）、直源同源群集数据库（clusters of orthologous groups，COG）、 基因功能和代谢途径数据库（ Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、 真核同源群数据库（euKaryotic orthologous groups，KOG）、去冗余的蛋白序列数据库（swiss prot protein database，Swiss-Prot）等数据库进行序列比对，获取基因的功能信息。

2.4差异表达基因（DEGs）分析

采用EBSeq进行DEGs分析，得到2个样品之间的差异表达基因集，采用Benjamini-Hochberg方法校正显著性P值（P-value）。以基因的相对表达量差异倍数（fold change，FC）≥2，FDR（false discovery rate）＜0.05作为标准，筛选DEGs。

2.5qRT-PCR分析

以枸杞组成型表达基因LbActin为内参（GenBank登陆号：HQ415754.1），选取转录组中识别的9个DEGs，进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析，qRT-PCR引物序列见表1。每个样品设3个生物学重复，采用TB Green Premix Ex Taq II试剂盒进行qRT-PCR检测，2 −ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

3 结果与分析

3.1转录组质量检测与组装

枸杞‘宁杞1号’和‘宁杞5号’单双核花粉期花药样品，各设置3个生物学重复，共6个样本进行转录组测序，经质控筛选，共获得51.58 Gb的Clean reads，且各样本Q30≥92.11%，各样品GC含量均大于43.02%（表2）。结果表明，所有试验样本测序质量良好，可用于后续研究。

对组装结果进行统计（表3），共检测到14 154条Unigene，N50为1170 bp，组装完整性较高，其中长度区间位于200～300 bp的Unigene数量最多，为4726条。

3.2DEGs功能注释

通过对雄性不育品种“宁杞5号”和可育品种“宁杞1号”单双核花粉期花药转录 本进行比较分析，获得的DEGs分别与NR、GO、COG、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot 7个数据库比对，有2327个基因匹配到了注释信息（表4），其中在NR数据库匹配到2321个，GO数据库1116个，COG数据库668个，KEGG数据库693个，KOG数据库1117个，Pfam数据库1769个，Swiss-Prot数据库1586个。

3.3 DEGs分析结果

雄性不育品种“宁杞5号”与可育品种“宁杞1号”单双核花粉期花药转录组比较分析，共检测到3012个差异表达基因（图2）。“宁杞5号”相对于“宁杞1号”，有1019个基因表达上调，1993个基因表达下调。

3.3.1GO 功能注释对DEGs进行GO功能注释（图3），有1116个DEGs被注释到生物学过程（biological process）、细胞组分（cellularcomponent）和分子功能（molecular function）中。其中，在生物学过程的代谢过程（metabolic process）、细胞过程（cellular process）和单生物过程（single-organism process）等二级功能占比较大，分别为628、548、511个；细胞组分中注释到的基因数目占比最多的属细胞部分（cell part），有362个；分子功能中注释到催化活性（catalytic activity）和蛋白结合（binding）功能的比例较高，分别为632个和539个。

3.3.2COG 功能注释DEGs中，有668个在COG数据库匹配到注释信息（图4），分别参与其中的22条代谢途径，属于常规功能预测（general function prediction only）的基因数目最多，有198个。在复制、重组和修复（reproduction、reorganization and repair）、碳水化合物运输与代谢（carbohydrate transport and metabolism）、信号转导机制（signal transduction mechanisms）和转录（tranion）等过程注释的基因数分别为96、91、80和83个。未检测到参与细胞运动、细胞外结构以及细胞核结构相关的差异表达基因。

3.3.3KEGG 功能注释差异表达基因在KEGG数据库中有693个基因匹配到注释信息，参与5大类代谢途径中的50条代谢通路（图5）。其中碳代谢（carbon metabolism)、氨基酸生物合成（biosynthesis of amino acids）、淀粉和蔗糖代谢（starch and sucrose metabolism）、苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）、内质网中的蛋白质加工（protein processing in endoplasmic reticulum）、植物病原体相互作用（plant-pathogen interaction）和植物激素信号转导（plant hormone signal transduction）分别富集到35、31、25、25、22、20和20个基因。

3.4雄性不育相关DEGs筛选

对“宁杞5号”和“宁杞1号”单双核花粉期花药转录组DEGs进行功能注释和代谢途径分析，同时参考PubMed数据库相关文献，筛选出细胞色素P450类蛋白（cytochrome P450 98A3-like，CYP450）、受体蛋白激酶（receptor-like protein kinase，RPK）、果胶裂解酶（pectate lyase-like，PLL）、查耳酮合酶（chalcone synthase，CHS）、花药特异蛋白（anther-specific protein，ASP）等23个参与花药发育及雄性不育相关基因（表5），这23个基因在雄性不育品种‘宁杞5号’中均下调表达，表明基因表达量的不同会影响植物的生长发育。

3.5DEGs的qRT-PCR分析

基于差异表达基因的GO、COG和KEGG 分析，从中挑选了与雄性不育相关性较高的细胞色素P450（cytochrome P450 98A3-like，CYP450）、查耳酮合成酶（chalcone synthase，CHS）、聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase-like，PG）、花药特异蛋白（anther-specific protein，ASP）、受体蛋白激酶（receptor-like protein kinase，RPK）等9个差异表达基因，进行qRT-PCR验证。结果表明qRT-PCR的表达模式与转录组测序结果基本一致（图6）。

4 讨论

转录组学研究可分析遗传背景相同、育性表型存在差异的植物材料，比较其基因表达量的变化特征，通过转录组分析，即使是无参考基因组的物种，也可以获得在某一状态下基因的表达丰度、剪接方式等信息[16]。在不同时空条件下，基因的上、下调表达变化与遗传背景和差异基因的功能密切相关，因此可通过分析基因表达水平变化的分析，来预测和研究基因功能的变化[17]。

本研究利用Illumina HiSeq2500高通量测序技术比较宁夏枸杞雄性不育品种“宁杞5号”和可育品种“宁杞1号”单双核花粉期花药转录组，筛选到3012个DEGs。其中，有1993个基因在雄性不育品种“宁杞5号”中下调表达，1019个基因上调表达，与Qu等[18]在油菜细胞核雄性不育系中的研究结果相一致。通过GO功能分类、KEGG代谢途径富集分析及PubMed文献检索，识别到23个DEGs与植物雄性不育相关。结合基因功能的文献报道，选取9个DEGs通过qRT-PCR验证分析，结果与转录组测序保持一致（图6）。

碳水化合物不仅对维持花药和花粉发育很重要，而且也是影响其发育的信号[19]。碳水化合物代谢紊乱可导致异常淀粉储存在药室内壁，也可导致绒毡层肥大和小孢子壁形成不良等其他症状，进而导致雄性不育[20]。淀粉和蔗糖是碳水化合物的重要组成部分，可以为花药发育提供能量。本研究有25个DEGs富集在淀粉和蔗糖代谢途径中（图5），这些基因的表达可能会导致淀粉和蔗糖代谢以及能量储备过程的紊乱，从而抑制花粉发育，最终导致雄性不育[20]。据此推测，碳水化合物的代谢可能会影响宁夏枸杞花药正常发育。此外，植物激素在开花植物的绒毡层和花粉发育中也具有重要作用。先前有研究表明，生长素作为第一种被鉴定的植物激素，在花粉发育中起着关键作用[21]。赤霉素是绒毡层正常发育所必需的，并影响绒毡层碳水化合物的可用性[22]。本研究结果有20个DEGs富集在植物激素信号转导途径中（图5），这些基因的异常表达，可能是造成枸杞雄性不育的原因之一。因此，推测生长素信号可能会影响花粉的正常发育。

值得注意的是，确定了23个与雄性不育相关的基因在不育品种“宁杞5号”中均下调表达，主要是与胼胝质降解、花粉管生长、绒毡层退化、花粉外壁形成以及花药角质层发育等有关（表5），推测这些基因的特异表达可能是雄性不育发生的原因。花药角质层和小孢子外壁是雄性配子体和花粉粒的保护屏障[23]。细胞色素P450家族成员CYP704 B2是植物雄性配子形成过程中角质层和外壁形成必不可少[23]。本研究中，CYP450（c13211.graph_c0）基因在不育品种“宁杞5号”花药转录组水平和qRT-PCR分析均下调表达，这与CYP450家族基因在棉花[24]中的表达模式类似。据此推测CYP450基因导致雄性不育发生的原因是与花药角角质层形成有关。受体样蛋白激酶2（RPK2）是拟南芥花药发育的关键调控因子，RPK2 T-DNA插入突变体rpk2-2破坏了绒毡层降解及绒毡层细胞命运的关键代谢途径，引起花药开裂和花粉成熟缺陷，导致拟南芥雄性不育[25]。本研究中，RPK（c34073. graph_c0）基因在不育品种“宁杞5号”花药转录组水平和qRT-PCR分析均下调表达，由此推测，RPK基因的低水平表达，可能是引起不育品种“宁杞5号”花药绒毡层细胞提前进行程序性死亡而解体，其花粉粒不能正常发育成熟的原因。植物β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase）参与植物花粉发育过程中胼胝质的降解[26]。本研究中发现，β- 1,3-glucanase （c12782.graph_c0）基因参与花粉发育且在不育品种“宁杞5号”中下调表达，推测β-1,3-glucanase基因的低水平表达是导致胼胝质降解的原因之一。Hou等[27]从拟南芥中报道了一个早期的结节样蛋白（ENs）基因，发现该基因对于花粉管进入胚珠、生长停滞和爆发有重要作用。他们研究发现，EN14可以和受体样激酶的细胞外结构域发生特异性结合，严格控制花粉管的接收。本研究发现，early nodulin-like protein 1（c62359. graph_c0）基因在不育品种“宁杞5号”中下调表达，因此我们推测不育的原因是该基因下调表达无法与受体结合，花粉管无法接收花粉导致。果胶裂解酶样（PLL）基因已经在各种植中得到鉴定，Zheng等[28]通过人工微RNA（amiRNA）对OsPLL3和OsPLL4的进行敲低，发现这2个基因表达降低时，会破坏正常花粉的发育并导致雄性不育。这与本研究PLL（c60080.graph_ c0）基因在不育品种“宁杞5号”中下调表达结果是一致的。Tsugama等[29]研究结果证明GDSL型脂肪酶基因（GELP）可以调节拟南芥中花粉壁的特性发生变化，GELP77缺陷（gelp77）植物表现出花粉壁发育异常，这种表型通过引入GELP77基因组片段而得到恢复。而本研究中发现GDSL lipase（c70271.graph_c0）基因在不育品种“宁杞5号”中下调表达，表明GELP77基因的高表达对于拟南芥花粉壁正常发育是必不可缺的。

此外，本课题组比较分析还发现了一个调控花 药开裂的转录因子NAC tranion factor 29-like（c39039.graph_c0）。NAC转录因子在前人的研究中已有报导，由一个涉及广泛生物过程的大基因家族组成[30]，其中有一些参与花粉发育（NST1、NST2）[31]。转录因子可以调节多个相关的下游基因，这些基因是细胞机制的重要组成部分，在植物生长发育中起着关键作用[32]。Mitsuda等[33]研究发现，NAC在拟南芥次生壁增厚过程中起重要作用，其中，次生壁增厚促进因子NST1和NST2的嵌合抑制因子的表达导致花药开裂缺陷，原因是花药内囊中次生壁增厚的丧失。本研究发现的NAC转录因子在不育品种“宁杞5号”中下调表达，推测其低水平表达是导致花药无法正常开裂的原因。

宁夏枸杞雄性不育单双核花粉时期花药转录组的研究结果，可为进一步通过转基因技术验证相关差异表达基因功能提供了候选基因资源，同时也为深入解析宁夏枸杞雄性不育发生的分子机制提供了研究基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：范文强，刘雪霞，马小兰，杨 花，朱金忠，唐建宁，岳思君，郑 蕊．利用转录组数据挖掘枸杞雄性不育相关基因 [J]. 中草药, 2023, 54(7):2226-2234.